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Nature子刊:阻塞性睡眠呼吸暫停(OSA)和阿爾茨海默病(AD)的聯(lián)系

更新時間:2023-05-05      點擊次數(shù):1478

阻塞性睡眠呼吸暫停(OSA)是睡眠呼吸障礙(SDB)中最常見的一種形式,是導致阿爾茨海默病發(fā)展的一個強有力的流行病學危險因素。據(jù)估計,大約 50% 的老年人患有阻塞性睡眠呼吸暫停(Obstructive Sleep Apnoea,OSA),他們的喉嚨肌肉在睡眠時間歇性收縮,阻塞氣道,導致呼吸停止和開始。當大腦缺氧時,會導致神經元的選擇性退化,這些神經元通常會在失智癥中死亡。







昆士蘭大學(University of Queensland,UQ)昆士蘭腦研究所(Queensland Brain Institute,QBI)和生物醫(yī)學科學學院(School of Biomedical Sciences)的 Elizabeth Coulson 教授和她的團隊在小鼠身上發(fā)現(xiàn)了睡眠時大腦缺氧和阿爾茨海默病之間的因果關系。研究結果近日發(fā)表在《Nature Communications》雜志上。


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該研究團隊開發(fā)了一種小鼠SDB模型,該方法復制了人類條件的關鍵特征:睡眠時的呼吸改變、睡眠中斷、中度低氧血癥和認知障礙。當在家族性AD模型中誘導SDB時,小鼠表現(xiàn)出認知障礙的加重和AD的病理特征,包括淀粉樣蛋白和炎癥標志物水平的增加,以及膽堿能基底前腦神經元的選擇性變性。這些病理特征并不是單獨由慢性缺氧或睡眠中斷而引起的。我們的研究結果還顯示,膽堿能神經退行性變是由核缺氧誘導因子1 alpha的積累介導的。此外,在睡眠期間恢復血氧水平以防止缺氧,可以防止SDB引起的病理改變。這些發(fā)現(xiàn)提示了SDB誘導膽堿能基底前腦變性的信號機制。






研究實驗

將C57BL/6麻醉后,為了誘導膽堿能( cMPT)病變,在背側被蓋核(laterodorsal tegmental nucleus) (LDT; AP, ?3.0?mm; ML, ±0.5?mm; DV, ?4.0?mm from Bregma, with the angle 34° backward)雙側注射 Urotensin II-SAPorin (UII- SAP; 0.07?μg/μl per site)。以相同的摩爾質量注射blank-SAPorin(Blank-SAP)或 IgG-SAPorin (IgG-SAP)作為對照。

為了測量睡眠狀態(tài),采用無線遙測技術測量腦電圖(EEG)、肌電圖(EMG)和活動節(jié)律。腦電電極被放置于運動皮層(AP+1, ML+1?mm,左,相對于bregma)和視覺皮層(AP?3, ML+3?mm,右,相對于bregma)。腦電電極用骨科水泥固定。肌電電極被錨定在斜方肌中。使用不可吸收的6-0縫合線材料縫合頭皮。


睡眠評價

電極放置手術兩周后,以500 Hz的采樣頻率記錄腦電圖和肌電圖。采用嚙齒動物睡眠評分軟件對清醒、REM或non REM(NREM)睡眠進行腦電圖和EMG記錄。REM期只有在≥1s長時才被考慮。由于電極放置而造成明顯腦損傷的對照組小鼠被排除在分析之外。

另一組小鼠使用代謝表型系統(tǒng)進行72小時的睡眠/覺醒參數(shù)評估,預先編程的光周期和光亮度控制晝夜節(jié)律。如果小鼠有≥10分鐘沒有運動,則認為它們睡著了。

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全身體積描記系統(tǒng)

使用全身體積描記系統(tǒng)對小鼠進行連續(xù)4小時的評估,期間記錄呼吸,同時記錄其他不受限制、自由運動的小鼠的腦電圖。小鼠被放置在一個全身體積描記器中。這種方法提供了一種間接的潮氣量測量,它與密封腔室呼吸過程中產生的循環(huán)腔室壓力信號成正比。首先讓小鼠30 min適應環(huán)境,然后持續(xù)記錄3小時數(shù)據(jù)。

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動脈血氧飽和度測量

使用MouseOx Plus小鼠脈搏血氧儀在室內空氣或環(huán)境室內記錄不受限制的清醒小鼠的動脈血氧飽和度。數(shù)據(jù)收集至少30 min,測量時儀器不能顯示錯誤代碼。然后對每只實驗條件的每只小鼠計算氧飽和度水平。

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曠場實驗

在一個正方形白色有機玻璃盒子(30 cm×30 cm)中進行30 min的曠場實驗。實驗箱被分為一個中心區(qū)(中心,15cm×15cm)和一個邊區(qū)(邊界)。使用攝像機記錄鼠標的運動,并使用視頻行為學系統(tǒng)軟件進行分析。以動物身體中心為參考點,計算總軌跡長度。

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Y 迷宮

Y迷宮由三個由有機玻璃組成的等距臂(120°,長35cm,寬10cm)組成。在訓練期間,小鼠被放置在其中一只臂(開始臂)中進入另一只臂,持續(xù)15 min。訓練后的一天,小鼠被允許在Y迷宮中探索10 min,并進入所有三個手臂。使用視頻行為學系統(tǒng)軟件對動物進行跟蹤,并分析在每只臂上花費的總時間和時間百分比。

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新對象識別

任務過程包括三個階段:適應、熟悉化和測試階段。在適應階段,小鼠被允許自由探索場地(40 cm×40cm)5 min。在熟悉階段,他們被放置在包含兩個相同樣本物體的場地,5 min,兩個物體都位于場地相對和對稱的角落。在1小時的記憶保留間隔后,小鼠和兩個物體放回到場地,一個與樣本相同,另一個為新物體,允許動物再次探索5 min。使用視頻行為學系統(tǒng)軟件跟蹤動物,并分析探索物體的時間百分比。

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主動位置回避(Active place avoidance)

該裝置由一個高架測試場組成,網格地板有一個透明的圓形邊界,側壁安裝視頻采集系統(tǒng)。測試場地順時針旋轉(1轉/分),電刺激可以通過網格地板傳遞。在適應后的第二天,小鼠每天進行4或5天的訓練,每天訓練小鼠持續(xù)10 min,避免 60° 的電擊區(qū),進入后導致短暫的足部電擊(500 ms,0.5 mA)。為了確定它們對電擊區(qū)的記憶,在最后一次訓練結束24小時后,小鼠被允許在不施加電擊的情況下探索場地10 min。使用視頻行為學系統(tǒng)軟件跟蹤分析動物行為。

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被動位置回避(Passive place avoidance)

被動位置回避行為范式被用于測試基礎前腦依賴的idiothetic navigation(依賴于自身運動信息的導航,自我主張)。這個導航任務使用了與主動位置回避任務相同的設備。然而,所有的外部線索都被消除,以減少allothetic navigation(依賴于外界信息的導航策略,異源導航),圓形邊界是不透明的灰色,競技場在整個實驗過程中保持靜止。小鼠經歷了5 min的適應階段,然后是10 min的訓練階段,訓練階段間隔1小時。訓練24小時后,小鼠被允許在電擊場不施加電擊探索5 min。


Morris水迷宮(Morris water maze)

訓練小鼠在水下1.5cm處找到一個平臺,在游泳時老鼠看不見它。每天進行3次試驗,每次60秒,試驗間隔30個min。在每次試驗中,小鼠以偽隨機的順序以三個標定的起點中的一個放入水箱中。如果老鼠在60秒內未能找到平臺,它們會被手動引導到平臺,并允許在平臺停留至少20秒。小鼠根據(jù)需要被訓練5天,以達到15s(逃避潛伏期)的訓練標準。探索實驗安排在最后一次訓練后24小時,包括一個沒有平臺的60秒試驗。使用視頻行為學系統(tǒng)軟件跟蹤測量動物游泳軌跡。

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睡眠剝奪(Sleep deprivation)

8只小鼠被放置在一個充滿水的睡眠剝奪箱(55cm×25cm)內,籠子里有9個圓柱體(直徑3cm),離水面1cm。睡眠剝奪籠和對照籠(有圓柱體,但無水)被放在一個氣候室(27?°C ,25% RH,光照周期為12:12小時)里。小鼠被放置在睡眠剝奪籠子中20小時和普通飼養(yǎng)籠中4小時。飼養(yǎng)籠在光照周期中光照的4小時也放置在在氣候柜中。小鼠通過視頻進行監(jiān)測,并每天稱重。

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Fig. 2: Urotensin II-SAPorin處理影響呼吸模式,在睡眠期間會誘發(fā)血氧不足。

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在清醒(A、B)或睡眠(C、D)期間注射對照空白SAP(A、C)或UII-SAP(B、D),采用全身體積描記記錄和對應的EEG記錄下進行靜態(tài)呼吸測量。統(tǒng)計數(shù)據(jù)是指對雄性和雌性小鼠的睡眠-覺醒配對雙向方差分析和Levene方差檢驗。

E UII-SAP組或對照組空白-SAP組雄性小鼠的平均多導睡眠測量(睡眠-覺醒配對雙向方差分析)f頻率,PIF峰值吸氣流量,PEF峰值呼氣流量,EIP吸氣時間,EEP呼氣時間,RT:

F注射UII-SAP和空白SAP的雄性小鼠在睡眠期間的清醒活動狀態(tài)的平均血氧飽和度水平。

G 注射了UII-SAP或對照組空白-SAP的雄性小鼠血氧飽和度水平的代表性趨勢圖。

數(shù)據(jù)表明, cMPT損傷的小鼠在睡眠期間具有高度可變的呼吸模式,平均而言,這與由于上呼吸道阻力而發(fā)生的吸入和呼氣措施的預測改變相一致,呼吸對呼吸的變化表明了由缺氧引發(fā)的恢復反應。大多數(shù)受損小鼠在睡眠中也表現(xiàn)出幾秒鐘的呼吸頻率下降,隨后是覺醒,這可以被解釋為呼吸暫停事件。此外,與最常見的SDB形式一致,在休息時,當 cMPT損傷小鼠在睡眠期間血氧測量30 min,發(fā)現(xiàn)血氧飽和度在80-90%左右,顯著低于空白小鼠的>95%(圖2F,G)。該結果表明, cMPT損傷影響呼吸模式,導致睡眠期間的輕度缺氧,這與氣道阻塞相一致。


Fig. 3: Urotensin II-saporin處理影響睡眠模式,導致睡眠不足。

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A 在亮燈(睡眠)和不亮燈(清醒)期間,REM、NREM和清醒期的平均數(shù)量。

B在亮燈(睡眠)和不亮燈(清醒)期間,REM、NREM和清醒睡眠的平均次數(shù)。

C 在開燈(睡眠)和不亮燈(清醒)期間,REM、NREM和清醒睡眠的平均長度。

D損傷(灰色)和UTII-SAP(紅色)損傷小鼠在睡眠狀態(tài)和睡眠和清醒之間移動的平均轉換次數(shù)。E在活動記錄的前48小時內,持續(xù)睡眠(持續(xù)至少10 min)的平均數(shù)量和時間和在12小時光照階段不活動的總時間

F在前48小時的12小時光期中不活動的總時間。

G一只對照組和一只受損傷的小鼠在12:12小時的光照:暗周期中超過3天的活動周期圖。在黑暗期的第3天,小鼠暴露于30 Lux昏暗的光線下3小時。

H實驗第3天12 h光期3h弱光期的活動時間。在注射UII-SAP(紫色)后2周開始的睡眠期2周內,小鼠每天放置40%含氧(高氧o2)8小時,與注射UTII-SAP的小鼠相比,沒有睡眠不足。


Fig. 4:  cMPT損傷加重了APP/PS1小鼠的認知功能障礙。

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A與熟悉(Fam)臂相比,在Y迷宮的新臂上花費的時間百分比。注射空白SAP的小鼠表現(xiàn)出對新臂的偏好,而 cMPT損傷的小鼠沒有偏好。

B Morris水迷宮訓練階段的逃逸潛伏期。在過去兩天的訓練中, cMPT損傷的APP/PS1小鼠尋找逃逸平臺的時間明顯更多。

C在Morris水迷宮的探索測試中到達平臺位置的潛伏期。兩組間的逃逸潛伏期無顯著性差異。

D主動位置回避試驗中每個訓練日小鼠接受的電擊次數(shù)。cMPT損傷的APP/PS1小鼠在最后兩天接受了明顯更多的電擊。

E  cMPT損傷的APP/PS1小鼠所接受的電擊次數(shù)顯著高于非損傷的APP/PS1小鼠


Fig. 7: 睡眠剝奪會導致認知功能障礙,但不會導致AD的病理變化

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A與熟悉的臂相比,在Y迷宮的新臂上花費的時間百分比。APP/PS1小鼠表現(xiàn)出對新臂的偏好,而睡眠剝奪的小鼠沒有偏好。

B C57Bl6小鼠在睡眠剝奪后的cBF神經元數(shù)量與對照組小鼠相當。

C海馬和皮質裂解液中可溶性Aβ的量未因睡眠剝奪而改變。

D APP/PS1小鼠海馬和皮層的面積受年齡影響,但不受睡眠剝奪的影響。


HIF1α介導了 cMPT損傷后的cBF死亡

為了測試cBF神經元是否因暴露于慢性缺氧條件而死亡,野生型雄性小鼠在睡眠期間每天暴露于降低的(80%)的氧氣條件下8小時,持續(xù)4周。在這一時期,cBF神經元的數(shù)量受到日常慢性缺氧沒有顯著不同的老鼠連續(xù)安置在常氧,表明慢性缺氧不能觸發(fā)相同的退行性途徑引起的 cMPT損傷。相比之下,慢性間歇性缺氧已被報道可誘導cBF神經元變性。


Fig. 8: 間歇性缺氧可引起 cMPT損傷后的cBF神經元丟失

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A C67Bl6小鼠在每日睡眠時間內每天在缺氧條件下暴露4周后的cBF神經元數(shù)量。

B 在空白-SAP(灰色)或UII-SAP小鼠中,每日用15mg/kg2ME2(藍色)或載體(紅色)處理3周后,細胞核中存在HIF1α免疫染色的cBF神經元的百分比。

C 4只動物的基底前腦切片的代表性共聚焦圖像,經ChAT(紅色)、HIF1α(綠色)和細胞核(DAPI;藍色)免疫染色。注射Blank-SAP(灰色)或UII-SAP,每天用15mg/kg2ME2(藍色)或載體(紅色)

D,E 處理3周后,小鼠cLDT (D)和cBF (E)神經元的數(shù)量。2ME2治療可保護cBF神經元免受損傷的影響。

F 在被動位置回避任務的測試階段,2ME2處理(藍色條)和未處理的UII-SAP損傷(紅色條)小鼠與空白SAP損傷小鼠(灰色條)的表現(xiàn)。

G UII-SAP注射的ChAT-cre HIF-1αfl/wt小鼠的cBF神經元數(shù)量與空白-SAP注射的ChAT-cre HIF-1αfl/wt小鼠無顯著差異。


預防缺氧可預防 cMPT損傷后的AD特征

人類患者阻塞性睡眠呼吸暫停的標準治療是在睡眠期間使用持續(xù)氣道正壓(CPAP)治療,這是在物理上維持氣道開放,從而防止血氧飽和度下降和睡眠喚醒。為了驗證對SDB小鼠在高氧環(huán)境下的睡眠階段進行治療是否可以保護cBF神經元免受 cMPT損傷誘導的細胞死亡和/或Aβ積累。

研究團隊使用高氧(40%)環(huán)境,將 cMPT損傷小鼠在睡眠階段的血氧水平恢復到>為95%的spo2。從病變手術后2周開始,年老的APP/PS1小鼠在12小時睡眠期間每天接受高氧治療,持續(xù)4周。該治療對 cMPT病變的范圍沒有影響。

然而,APP/PS1中cBF神經元的數(shù)量(圖9b;和野生型圖3E)高氧處理的 cMPT損傷動物明顯高于未處理的損傷小鼠,與標準飼養(yǎng)籠中的假損傷動物相似(圖9B),從而證實了cBF變性是SDB表型的結果。

此外,在損傷的APP/PS1隊列中,每日高氧治療顯著降低了淀粉樣蛋白病理程度(圖9C、E)和炎癥程度(圖9F-H)。


Fig. 9: 高氧治療可防止OSA加重AD表型

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APP/PS1小鼠注射UII-SAP并經常氧或高氧處理后,

cLDT (A)和cBF (B)神經元的數(shù)量

新皮質中硫黃素-s陽性Aβ斑塊的數(shù)量(C)和面積(D)。

新皮質中GFAP陽性小膠質細胞的密度(E)和面積(F)。

新皮質中cd68陽性星形膠質細胞的密度(G)和面積(H)。






睡眠呼吸障礙會導致睡眠期間大腦缺氧,大腦缺氧會導致神經元的選擇性退化,而這些退化神經元,通常會在癡呆癥中死亡。當研究人員剝奪小鼠睡眠時,并沒有發(fā)現(xiàn)引起與這種睡眠呼吸障礙相同的病理特征,即便是睡眠剝奪確實會損害記憶。研究人員認為,睡眠呼吸暫停似乎是導致阿爾茨海默氏癥發(fā)展的風險因素。

 

“目前還沒有有效逆轉阿爾茨海默病的方法,因此預防疾病的發(fā)生就顯得尤為重要。這就需要我們了解哪些原因能導致特發(fā)性疾病的發(fā)生。"錢磊博士指出,“睡眠呼吸障礙是癡呆癥發(fā)生的一個重要的流行病學風險因素,與發(fā)病年齡提前、認知能力下降增快有關。我們的工作為這種流行病學聯(lián)系提供了機制,也對識別高危人群具有重要意義。"

 

Elizabeth Coulson教授表示:“下一步我們將利用已有的動物模型,研究在睡眠呼吸障礙過程中,參與基底前腦膽堿能神經元病變的分子通路,并尋找潛在的候選分子阻止上述病變發(fā)生。此外,一項關聯(lián)睡眠呼吸障礙、MRI腦成像與癡呆癥的臨床試驗也在進行,進一步確認對睡眠呼吸障礙的干預是否能延緩或阻止癡呆癥的發(fā)生。"


Qian, L., Rawashdeh, O., Kasas, L. et al. Cholinergic basal forebrain degeneration due to sleep-disordered breathing exacerbates pathology in a mouse model of Alzheimer’s disease. Nat Commun 13, 6543 (2022). 






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